Tecnologie

AAVantgarde Bio dispone di due esclusive piattaforme tecnologiche per il trasferimento di geni di grandi dimensioni, entrambe basate su vettori virali adeno-associati (AAV).

La nostra tecnologia si focalizza sull’utilizzo di due processi distinti: un processo di ricombinazione a livello del DNA, utilizzato nella piattaforma denominata “AAV doppio ibrido”, un processo di ricombinazione a livello proteico noto come trans-splicing proteico, utilizzato nella piattaforma denominata “AAV inteine”. L'azienda sta validando queste due piattaforme in due programmi principali: la retinite pigmentosa associata alla sindrome di Usher di tipo 1B (USH1B), dove viene impiegata la piattaforma AAV l doppio ibrido, e la malattia di Stargardt, dove si utilizza la piattaforma AAV inteine.

In passato la terapia genica con AAV è stata fortemente limitata capacità di tali vettori di trasferire geni molto grandi. Al contrario, le nostre piattaforme consentono l’introduzione di geni di grandi dimensioni in tessuti e cellule in vivo, con la possibilità di un’eventuale estensione a diverse aree terapeutiche.

Piattaforma AAV Doppio Ibrido 

Questa piattaforma utilizza due vettori AAV, ciascuno contenente una metà di una cassetta di espressione codificante per un transgene terapeutico di grandi dimensioni e lavora a livello del nucleo cellulare, ricombinando le due metà del transgene terapeutico all'interno della cellula. 


Nella piattaforma AAV doppio ibrido, un segnale donatore di splicing (SD) è posto all'estremità 3′ del vettore -codificante la metà 5’ del transgene terapeutico e un segnale accettore di splicing (SA) è posto all'estremità 5′ del vettore codificante la metà 3’ del transgene terapeutico. Inoltre, nel doppio ibrido, una sequenza altamente ricombinogenica (HR, di proprietà di AAVantgarde BIO) è posta a valle e a monte delle sequenze SD e SA rispettivamente, per aumentare l’efficienza di ricombinazione tra le due metà di DNA. A seguito della coinfezione della stessa cellula da parte dei due vettori AAV, concatamerizzazione testa-coda delle due metà mediato dalle sequenze terminali invertite (ITR) e dalla sequenza HR, portano alla formazione di un singolo genoma che viene poi trascritto in un RNA; successivamente il processo di splicing elimina le sequenze ricombinogeniche indesiderate (ITR e HR), e porta alla generazione di un mRNA maturo completo che viene poi tradotto in una proteina funzionale.

Ref: Trapani I., Colella P., et. al. Effective delivery of large genes to the retina by dual AAV vectors. Embo Molecular Medicine, February 2014.

Piattaforma AAV-inteine 

Questa piattaforma utilizza due vettori AAV, ciascuno dei quali contiene una cassetta di espressione codificante per una delle due metà di una proteina target affiancata da brevi sequenze, note come “split inteine”. Funziona mediante un meccanismo di trans-splicing proteico all'interno della cellula e ha dimostrato una ricombinazione molto efficiente nel generare livelli significativi della proteina target.


 

Il processo di trans-splicing proteico mediato dalle split-inteine è utilizzato da organismi monocellulari per ricostituire proteine di grandi dimensioni. La somministrazione di vettori AAV multipli, ciascuno codificante uno dei frammenti di una proteina target affiancati da brevi split-inteine, determina attraverso il trans-splicing la ricostituzione dell’intera proteina nella retina di topi e maiali e in organoidi retinici umani. La ricostituzione di grandi proteine terapeutiche mediante questo approccio ha migliorato il fenotipo di due modelli murini di malattie retiniche ereditarie. I nostri dati supportano l'uso del trans-splicing proteico mediato da split-inteine in combinazione con la somministrazione subretinica di AAV per la terapia genica di forme ereditarie di cecità dovute a mutazioni in geni di grandi dimensioni.

Ref: Tornabene P., Trapani I., et al. Intein-mediated protein trans-splicing expands adeno-associated virus transfer capacity in the retina. Science Translational Medicine, May 2019.